Заповедник расположен в Западно-Манычском природном районе зоны типчаково-ковыльных степей. Флора заповедника насчитывает 503 видов растений в том числе, 22 вида, включенный Красную Книгу Ростовской области и среди них , 9 видов растений занесены в Красную книгу России.
В травостое доминируют типчаки, ковыли и житняки. В составе сообществ галофитов преобладают грудница мохнатая, солонечник растопыренный, ромашник тысячелистниковый, зопник колючий, тысячелистники - благородный и щетинистый, а в более засоленных местообитаниях - кермек Гмелина, камфоросма, лебеда бородавчатая.
Из редких растений в заповеднике отмечены ковыль Залесского, тюльпан Шренка, майкораган волжский, беллевалия сарматская и другие.
Фауна млекопитающих насчитывает 34 вида. Из них один – хорь перевязка – внесен в Красную книгу России. Типичные обитатели сухих степей – ушастый еж, большой тушканчик, тарбаганчик – ставшие редкими на пространствах степной зоны Европы, сохраняются в заповеднике. Эти виды внесены в Красную книгу Ростовской области.
На заповедных участках обитают: лисица обыкновенная, корсак, степной хорь, заходят сайгаки. На Островном участке обитает вольный табун одичавших лошадей. На Стариковском участке отмечены волки.
Особенно богато пернатое население заповедника и прилегающих степей, включающее 256 видов птиц, 27 видов включены в Красную Книгу России.
В составе орнитофауны преобладают гнездящиеся водоплавающие и околоводные птицы - чомга, серошейка, черношейная и малая поганки, кудрявый и розовый пеликан, большой баклан и другие. В пределах заповедника расположены колонии околоводных птиц, в которых ежегодно гнездится несколько десятков "краснокнижных" колпиц. Через район заповедника проходит один из крупнейших пролетных путей гусеобразных, образующих здесь массовые концентрации в периоды весеннего и осеннего пролета. Помимо наиболее массового белолобого гуся, здесь ежегодно образуются огромные скопления краснозобой казарки, вида, занесенного в Красную книгу. Многочисленны кулики, веретенники, чибисы, черныши, шилохвостки, авдотки, ходулочники и др. Условия заповедника благоприятны для хищных птиц, в том числе редких. Здесь встречается степной орел, беркут, могильник, скопа, орлан-белохвост, четыре вида луней: болотный, луговой, полевой и степной, обыкновенная и степная пустельга, балабан, дербник, чеглок и др. Из ночных хищных птиц там обитают филин, болотная и ушастая сова, серая неясыть, сплюшка, мохноногий сыч. В Ростовском заповеднике много вездесущих воробьиных: жаворонков, коньков, трясогузок, славок, пеночек, овсянок, иволг, ласточек, скворцов и др.
Важное значение заповедные участки степи имеют для сохранения дрофы и стрепета — птиц, ставших редкими из-за уничтожения их коренных биотопов. Насекомые заповедника мало изучены их количество 1563 вида, из них 7 включены в Красную Книгу России.